CAR-T治療又稱嵌合抗原受體T細胞治療，是將人的T細胞經(jīng)過基因工程手段體外修飾改造后，回輸至患者體內(nèi)，用于治療疾病。

目前生產(chǎn)CAR-T細胞療法的主要步驟包括最初分離和富集T細胞、T細胞活化、使用病毒或非病毒載體系統(tǒng)進行CAR基因轉(zhuǎn)移、體外CAR-T細胞擴增，CAR-T細胞質(zhì)控以及最后的末端工藝和冷凍保存，整個制造周期一般需要2~4周。

CAR-T生產(chǎn)的各個階段和工藝方案示例

分離及富集T細胞

生產(chǎn)CAR-T的第一步，是通過白細胞分離術(shù)從患者（或同種異體的供體）處收集外周血單核細胞（PBMC）；然后利用基于磁珠的技術(shù)分離出特定的T細胞亞群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T細胞。

CAR-T載體構(gòu)建及包裝

實現(xiàn)CAR在T細胞上的表達是CAR-T生產(chǎn)的核心技術(shù)，這一步需要利用到載體將CAR基因?qū)隩細胞。理想的載體應(yīng)該具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率、穩(wěn)定性好，不引起機體免疫反應(yīng)等特點。

目前有多種方法用于T細胞修飾，包括病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo) （如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒載體等）及非病毒載體轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染、電穿孔等技術(shù)等）。其中慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)用較為廣泛。

慢病毒載體設(shè)計可以用來實現(xiàn)哪些實驗?zāi)康模?/p>

通過引入組織特異性啟動子和/或miRNA靶基因?qū)崿F(xiàn)組織特異性表達，消除脫靶效應(yīng)；

用單個載體表達多個蛋白質(zhì)可以通過使用IRES、雙向啟動子或由自切割的2A多肽分開多可讀框；

shRNA和miRNA表達；

生成cDNA、shRNA和miRNA文庫；

由藥物調(diào)節(jié)的基因表達。

LV載體制備

LV生產(chǎn)的上游工藝主要包括細胞培養(yǎng) （分為懸浮/貼壁培養(yǎng)等）和病毒包裝；下游工藝一般涉及澄清、純化、過濾、濃縮、除菌等步驟。與細胞分離步驟一樣，載體的無菌性至關(guān)重要，因為最終的CAR-T細胞產(chǎn)物無法通過過濾進行滅菌。

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T細胞擴增

體外培養(yǎng)，大量擴增CAR-T細胞至治療所需劑量，一般為十億至百億級別。

CAR-T細胞質(zhì)控

回輸CAR-T細胞，嚴密監(jiān)護病人，觀察療效并嚴密監(jiān)測不良反應(yīng)。

山東麗山生物科技有限公司( 以下簡稱“麗山生物”)是麗山健康（山東）集團有限公司的全資子公司，專注于細胞與基因治療CDMO服務(wù)，業(yè)務(wù)涉及免疫細胞治療、基因治療、干細胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，聚焦質(zhì)粒生產(chǎn)、基因載體制備、CAR-T細胞工藝開發(fā)，擁有山東省首家由省科技廳認可的免疫細胞與基因治療CDMO中試基地。實驗室及廠房總建筑面積6500平方米，建有1條質(zhì)粒生產(chǎn)線、2條基因載體生產(chǎn)線、6條 CAR-T 細胞生產(chǎn)線，配有國際領(lǐng)先的研發(fā)及生產(chǎn)設(shè)備，為細胞與基因治療創(chuàng)新藥物臨床批件的申報提供CMC工藝開發(fā)服務(wù)，有力助推細胞與基因治療領(lǐng)域醫(yī)藥創(chuàng)新企業(yè)產(chǎn)品上市進程。

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